PCR

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengisolasi DNA genom yang berasal dari darah sapi segar. Selanjutnya hasil dari isolasi tersebut akan diimplifikasikan dengan teknik in- vitro menggunakan PCR (Polimerase Chain Reaction) sehingga menghasilkan fragmen DNA spesifik sesuai dengan yang kita inginkan dalam jumlah banyak dan waktu singkat. Hasil dari PCR tersebut dapat diperiksa dengan proses elektroforesis dan dilihat di bawah paparan sinar UV untuk mengetahui ukuran dari DNA genom yang berasal dari darah sapi tersebut.

Proses pertama yang dilakukan adalah mengisolasi DNA genom dari sapi. Pada mamalia, DNA berada pada sel darah putih sehingga untuk mengisolasinya dapat dilakukan dengan sentrifugasi berulang. Langkah pertama yang dilakukan ialah mengambil sampel darah yang kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan cell lysis solution ke dalamnya. Solution ini berfungsi untuk melisiskan sel darah merah. Setelah didapatkan pellet sel darah putih dari sentrifugasi, langkah selanjutnya ialah menambahkan nuclei lysis solution untuk melisis inti sel darah putih. Setelah itu ditambahkan protein precipitation solution untuk mengendapkan protein serta sisa-sisa sel yang tidak terpakai. Kemudian disentrifugasi, supernatan dipindahkan pada tabung eppendorf baru dan tambahkan isopropanol hingga terbentuk benang-benang putih DNA. Sentrifugasi kembali dan ditambahkan etanol 70%. Isopropanol dan etanol 70% ini berfungsi untuk menarik molekul air dari DNA sehingga DNA dapat mengendap. Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang, tarik sisa etanol dengan pipet, dan kering-udarakan pellet selama 10-15 menit sampai pellet berwarna putih. Setelah itu, tambahkan DNA rehydration solution pada tabung untuk proses rehidrasi pada DNA dan inkubasikan semalam pada suhu 4C agar proses tersebut berjalan sempurna.
Selanjutnya dilakukan PCR untuk mengamplifikasi DNA. Pada praktikum ini, yang diamplifikasi ialah intron III dan IV dari hormon pertumbuhan sapi. Teknik PCR ini melalui tiga tahap yaitu denaturasi, annealing primer, dan ekstensi.
Teknik PCR ini diawali dengan memasukkan DNA template yang berasal dari isolasi DNA genom darah sapi sebanyak ke dalam tabung. Kemudian ditambahkan sepasang primer yang berfungsi untuk memperbanyak sekuens. Kedua primer tersebut ialah GH5 sebagai primer forward dan GH6 sebagai primer reverse.
GH5 : 5’ – AGAATCAGGCCCAGCAGAAATC – 3’
GH6 : 5’ – GTCGTCACTGCGCATGTTTG – 3’
Langkah selanjutnya adalah menambahkan dNTP mix yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP. Kemudian ditambahkan Taq Polymerase, ddH2O, dan Taq buffer untuk arus listrik. Untuk meningkatkan spesifikasi DNA ditambahkan MgCl2.
Tabung yang berisi berbagai larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR. Untuk denaturasi awal dilakukan hot start pada suhu 94C selama 5 menit agar DNA terdenaturasi sempurna. Kemudian diikuti dengan 30 siklus dengan tiap siklus melalui tahapan denaturasi pada suhu 94C selama 45 detik, annealing pada suhu 60C selama 45 detik, dan ekstensi pada suhu 72C selama 1 menit. Pada akhir proses ini ditambahkan proses ekstensi selama 5 menit untuk memastikan seluruh proses ekstensi telah selesai.
Hasil pelipatgandaan DNA dari proses PCR kemudian dapat dilihat dengan proses elektroforesis. Dengan elektroforesis, DNA hasil PCR dapat diketahui ukurannya. Pada praktikum kali ini, jenis elektroforesis yang digunakan ialah elektroforesis zona yaitu menggunakan media penunjang yaitu agrose, suatu polisakarida yang dapat melewatkan molekul-molekul besar. Elektroforesis yang dilakukan ialah sistem horizontal. DNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah kutub positif melalui molekul-molekul agarose.
Proses elektroforesis diawali dengan pembuatan gel sebagai medianya yaitu agarose dilarutkan ke dalam TAE 10 X 50 mL yang telah dibuat sebelumnya yang terdiri dari Tris Base 24,2 gr, asam asetat glacial 5,31 mL, EDTA 0,5 mM 10 mL. EDTA merupakan salah satu komposisi pembentukan gel dan buffer yang berfungsi sebagai salah satu alat bantu untuk mengalirkan DNA sampel pada buffer. Kemudian tambahkan ethidium bromida (EtBr) yaitu pewarna yang dapat menyisip atau interkalasi diantara basa DNA pada dua utas DNA yang berlainan sehingga pada saat dibawah paparan sinar UV dapat berpendar. Setelah itu, tuangkan ke dalam cetakan lalu dibiarkan pada suhu kamar sampai mengeras.
Sampel DNA yang akan dielektroforesis dicampur dengan loading buffer, yang terdiri dari sukrosa sebagai pemberat agar sampel dapat tenggelam ke dasar gel dan tidak melayang ke luar dan pewarna yang menandai kemajuan proses elektroforesis dan menentukan kapan saatnya harus menghentikan proses yaitu Bromophenol blue (4 kbp), Xylene cyanol (100 bp), dan Orange G (50 bp), dan kemudian diletakkan pada parafilm sebelum ditaruh di sumur-sumur gel. Setelah itu, masukkan juga DNA ladder sebagai marker DNA. Kemudian tutup tanki, sambungkan dengan sumber listrik (120 V), dan tunggu hingga penanda laju migrasi sampai di bagian bawah gel.
Hasil elektroforesis yang dilihat di bawah paparan sinar UV menunjukkan bahwa terbentuk band pada keempat sumuran. Namun masing-masing fragmen mempunyai ukuran sama dan berbeda. Pada sumuran 1, 2, dan 4 ukuran fragmen yang ditunjukkan adalah sama yaitu 223 bp. Sedangkan pada sumuran ke-3 ukuran fragmen berbeda dengan lainnya yaitu 171 bp.